Получение соответствующего фрагмента нуклеиновой кислоты

В случае необходимости получения специфических мРНК, ко­дирующих индивидуальные структурные белки возбудителя, исполь­зуют следующий способ. Инфицированные вирусом клетки разрушают механическим путем или химическими методами (использование неионных детергентов). Клеточный лизат освобождают от ядер и митохондрий методом диф­ференциального центрифугирования и подвергают хроматографии на антительном сорбенте. При этой процедуре с антителами, специ­фичными к определенному структурному белку возбудителя, связы­ваются полисомы, осуществляющие синтез этого белка. Также может быть использован метод непрямой иммунопреципитации полисом, при котором комплекс антитело - полисома преципитируется из раствора добав­лением второго антитела, специфичного к первому. В качестве второ­го антитела чаще всего берут фиксированные формалином клетки Staphilococcus aureus, на поверхности которых находится так назы­ваемый белок А, имеющий сродство к Fc-фрагментам Ig. Из полисом, полученных одним из описанных способов, далее уже выделяют мРНК.

Другой путь выделения индивидуальных мРНК базируется на свойстве мРНК взаимо­действовать с комплементарными ДНК, связанными с твердым носи­телем (целлюлоза, сефароза, нитроцеллюлозные фильтры). Этот ме­тод отбора и очистки специфических мРНК является самым эффективным. Однако его применение возможно только при наличии соответст­вующих комплементарных ДНК.

Получение препарата очищенной мРНК позволяет перейти к ра­ботам по синтезу гена с помощью обратной транскрипции, которую осуществляют с помощью ревертазы AMV в специально подобран­ных условиях. В процессе обратной транскрипции матрицей служит мРНК, а затравкой олиго(dT12-18) (для мРНК, имеющих поли(А)-тракт) или химически синтезированный олигонуклеотид, комплемен­тарный 3'-концу мРНК. После синтеза на мРНК компле­ментарной цепи ДНК и разрушения РНК (чаще используется обра­ботка щелочью) осуществляют синтез второй цепи ДНК. В этой реакции матрицей служит первая цепь ДНК. Реакция может катали­зироваться как ревертазой, так и ДНК-полимеразой.

После получения двухцепочечной кДНК следует стадия получения гена, заключающаяся в гидролизе одноцепочечного участка ДНК, соединяющего первую и вторую цепи, нуклеазой S1.

Для получения необходимых участков РНК используют две группы способов: 1) расщепление полирибонуклеотидной цепи РНК в заданном месте; 2) синтез РНК (ферментативный на ДНК- или РНК-матрицах и химический).

Расщепление полирибонуклеотидной цепи РНК может осуществляться в присутствии различных ферментов. Для этой цели используют ферменты: рибонуклеазу H, нуклеазы, ковалентно связанные с олигонуклеотидами (например, стафилококковая нуклеаза), рибозимы (например, рибозим L-19).

Исторически первым способом направленной ферментативной фрагментации РНК (называемой также адресованной, сайт-направленной или сайт-специфической фрагментацией РНК) является разработанный в Московском университете метод гидролиза РНК ферментом РНКазой H в присутствии комплементарных олигодезоксирибонуклеотидов. Этот метод до сих пор остается наиболее универсальным способом направленной фрагментации РНК.

Метод основан на свойстве РНКазы Н расщеплять полирибонуклеотидную цепь РНК в составе ДНК-РНК-гетеродуплекса. К участку РНК, по которому планируется провести ее фрагментацию, синтези­руется комплементарный олигодезоксирибонуклеотид длиной в 6-10 нуклеотидных остатков. Далее получают комплекс этого олигонуклеотида с РНК, который затем обрабатывают ферментом. В работе обычно используют РНКазу Н из Escherichia coli - вполне доступный фермент, который может быть довольно легко очищен от всех сопутствующих нуклеазных примесей. Этот метод нашел достаточно широкое применение для сайт-специфического расщепления вирусных и рибосомных РНК, а также для иден­тификации продуктов процессинга некоторых РНК.