Стратегия клонирования генов

Трансляция мРНК может быть осуществлена в бесклеточной системе. Однако в случае эукариотических генов мРНК часто перено­сят в ооциты лягушки (ксенопуса) с помощью техники микроинъек­ции, где она транслируется. Продукт трансляции обычно обнаружива­ют с помощью антител.

Далее в подгруппе, где обнаружен искомый ген, тем же методом исследуется каждый клон.

При наличии зонда с чашки Петри, на которой выращены колонии клеток, делается отпечаток (реплика) на нитроцеллюлозном фильтре. Клеткам дают вырасти на фильтре, затем их разрушают, подвергают ДНК щелочной денатурации и фильтр прогревают при 80°С, после чего ДНК необратимо с ним связывается. Фильтр отмыва­ют от примесей и обрабатывают радиоактивным "зондом" в условиях, оптимальных для ДНК-ДНК- или ДНК-РНК-гибридизации. После удаления избытка "зонда" методом ауторадиографии определяют поло­жение клеточного клона, содержащего участок ДНК с нуклеотидной последовательностью, комплементарной "зонду". Этот клон становит­ся затем источником клеток для получения искомого гена или его фрагмента.

Для селекции клонов, несущих необходимый ген, достаточно широко применяются и иммунологические методы. Принцип отбора на первых этапах тот же, что и при использовании ДНК- и РНК-зондов. Далее с колоний с рекомбинантными ДНК делается реплика с помощью полимерной пластинки, на которой закреплены антитела к продукту искомого гена. Положение клонов, вырабатывающих этот белок, опре­деляется также с помощью антител, но уже меченных радиоактивным йодом (125I).