Обнаружение вирусов.

Обнаружить присутствие вирусов и определить их количество можно с помощью целого ряда различных тестов, например:

1) Активность вируса измеряется путем определения количества содержащего вирус материала, необходимого для того, чтобы вы­звать специфическую реакцию в организме хозяина. Индуцируе­мая вирусом реакция может происходить по типу «все или ничего» (т. е. наличие или отсутствие инфекции), а может быть выражена количественно, например продолжительностью времени, необходи­мого для проявления инфекции, или числом поражений в слое чувствительных клеток. Количественное определение вирусной ак­тивности называется титрованием.

Наименьшее количество вируса, способное вызвать соответст­вующую реакцию, называется инфекционной единицей, и титр ис­ходной вирусной суспензии выражается числом инфекционных еди­ниц, приходящихся на единицу объема. Например, если минималь­ное количество суспензии вируса гриппа, вызывающее у мыши пневмонию при интраназальном введении суспензии ткани инфи­цированного легкого в разведении 1:106 равно 0,1 мл, то это значит, что титр вируса гриппа в исходной суспензии ткани лег­кого равен 107 инфекционным единицам на 1мл—1/(10~1-10-6) =107.

Как правило, обязательным компонентом метода титрования вируса является тест, позволяющий оценить результат инокуляции как положительный или отрицательный. Например, при титровании вирусов животных таким тестом может быть наличие или отсутствие видимых поражений в культуре клеток, воспалительная реакция на месте инокуляции вируса в кожу или роговицу, параличи, возникающие у животного в результате введения вируса в мозг, и т. д. Иногда размножение вируса можно выявить и в отсутствие видимой реакции со стороны организма-хозяина: на пример, заражение куриных эмбрионов миксовирусами можно обнаружить по появлению гемагглютининов в аллантоисной жидкости.

Наилучшие результаты дают методы титрования, в основе ко­торых лежит подсчет числа дискретных поражений на определенной площади слоя клеток, зараженных известным количеством содержащего вирус материала. В случаях когда число чувствительных к вирусу и доступных для него клеток можно практически считать бесконечно большим, как, например, при заражении фа­гом однослойной культуры бактерий на питательном агаре или при заражении вирусом сплошной однослойной культуры живот­ных клеток, поражения, вызываемые вирусом, или бляшки, образуемые фагом, в данном смысле подобны колониям бактерий на плотной питательной среде. Как число этих колоний пропорцио­нально числу бактериальных клеток, содержащихся в титруемом препарате, так и число бляшек прямо пропорционально количеству вируса, добавленному к однослойной культуре образование зараженными клетками вирусных частиц, которые могут быть идентифицирован, например, по природе нуклеиновых кислот и симметрии частиц.

2) Образование зараженными клетками нуклеиновых кислот, которые могут обладать характерной плотностью при цент­рифугировании в градиенте плотности или характерным размером при электрофорезе в агарозном геле или центри­фугировании в градиенте концентрации сахарозы.

3) Образование зараженными клетками или трансформирован­ными клетками характерных антигенов, которые могут быть визуализованы с помощью окрашивания флуоресцирующими специфическими антителами либо вызывать изменения в клеточной мембране, приводящие к адсорбции гема. В прямом методе антитела, полученные к вирусным антигенам, сочетаются с флуорохромом и используются для окраски за­раженных клеток. Положительная реакция (желто-зеленый цвет в люминесцентном микроскопе) указывает на присутствие в клетках вирусных антигенов. Этот метод, следовательно, мо­жет быть использован для выявления клеточной трансформа­ции, когда антитела вырабатываются, например, против ран­них антигенов вируса SV40, или для выявления образования зрелых вирусов, когда получаются антитела против капсидных белков. В непрямом методе антитела не сочетаются с флуорохро­мом. Вместо этого после взаимодействия антител с антигенами в фиксированных препаратах клеток к ним добавляются антигамма-глобулиновые антитела, конъюгированные с флуорохро­мом. Этот метод более чувствителен и позволяет избежать конъюгации каждого индивидуального антитела с флуоресцент­ным красителем. Так, одни и те же флуоресцентные антитела к антителам кролика (полученные у овец против кроличьих гамма-глобулинов) могут быть использованы для окраски лю­бых антител, образующихся у кроликов и взаимодействующих с вирусными антигенами в продуктивно зараженных или транс­формированных клетках. Еще более непрямой, но значительно более чувствительный метод, не требующий использования флуоресцентного микро­скопа - пероксидазный - антипероксидазный метод. Согласно этому методу, кроличьи антитела взаимодейст­вуют с антигенами фиксированных клеток и затем покрывают­ся антителами козы к иммуноглобулинам кролика, конъюгированными с комплексами пероксидазы хрена и кроличьей антипероксидазы. После этого препараты обрабатывают диамино-бензидином и перекисью водорода; коричневая окраска указы­вает на присутствие антигенов.